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      产品详情
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      产品编号B861407476762
      产品型号 Saier-TS5
      产品规格
      所属品牌 赛尔生物
      销 售 价 30,000
      所 在 地 天津
      更新时间2014-08-08
      产地 中国
      产品详情

       

      siRNA干扰服务
      天津赛尔生物的siRNA干扰服务由参与主编《RNA干扰:原理与应用》的工作人员,可以根据客户的需求,提供从siRNA设计到合成,shRNA质粒的构建,转染,病毒包装siRNA,RT-PCR及WB验证的一站式服务,让RNA干扰不再干扰您的科研。
       
       
      技术背景:
      RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰,可以特异地将特定的基因沉默,从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低,因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等。
       
         
      2:基于化学合成的双链siRNA,基于载体的shRNA构建,病毒系统包括慢病毒( lentiviral ) 、逆转录病毒( retroviral ) 和腺病毒 ( adenoviral ) 包装siRNA
      3:体外通过转染或感染的方式导入siRNA
      4:RT-PCR,WB检测干扰效果
       
      交付内容
      1:siRNA序列
      2:采用质粒转染方式的,交付构建好的shRNA质粒。采用病毒系统包装siRNA的,交付含有包装shRNA序列的重组病毒。
      3:RT-PCR,WB检测结果。赛尔承诺,对于一些非公开siRNA序列基因的siRNA设计的干扰效果,三条序列中至少有一条干扰效果在75%以上
      4:详尽的操作步骤及实验结果
      常见问题及解答
      问1:怎样设计siRNA序列?
      siRNA序列的设计一般遵照以下的步骤和原则
      1. 在所选基因的启动子后 50-100个碱基自5’-端开始
      2. 寻找基因序列中的23个碱基, 最好是5‘- AA(N19)TT -3’ (N是任何碱基)
      3. 如果找不到四个以上AA(N19)TT,则用 AA(N21)补足。
      4. 如果找不到四个以上AA(N21), 则用 NA(N21)补足。
      5. 所选定序列中,G和C的数目的总和在总数(23)的35-55%.
      6. 满足以上1-5项要求的片段数目如果不足四个,将G和C的数目的总和放宽至总数(23)的30-70%.
      7. 选好上述序列后,以此确定所需合成双链RNA oligo 的序列如下:
      8. 正义序列 (N19)TT 与上述选定的23 个碱基序列中的第3-23个碱基相同
      9. 反义序列的3’----5’ 的序列与目标序列中的第1-21个碱基互补, 即A变成T,C变成G, T变成A, G变成C。
      10. 将反义序列3’----5’ 改写成 5’----3’.
      11. 将最后所得序列中除3’- 末端的两个碱基之外的所有碱基中的T都用U来替代。 最后每三个组成一个字节,中间断开。
      12. 将所选定的正义序列和反义序列与gene bank 中已知同物种的基因序列进行比较,确定其唯一性(BLAST)
      13. 上述 7-10 项可见如下例子:
      假如通过1-5 项的条件选出的一段23 个碱基的序列是
      5’- AAGCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’
      正义序列就应该是: 5’- GCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’
      反义序列就应该是: 3’- TTCGATCAGTACCGGTAACTG -5’
      反转处理后即得:
      正义序列: 5’- GCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’
      反义序列: 5’- GTCAATGGCCATGACTAGCTT -3’
      U替代T以后得到:
      正义序列: 5’- GCUAGUCAUGGCCAUUGACTT - 3’
      反义序列: 5’- GUCAAUGGCCAUGACUAGCTT -3’
      段开字节后最后得到:
      正义序列: 5’- GCU AGU CAU GGC CAU UGA CTT - 3’
      反义序列: 5’- GUC AAU GGC CAU GAC UAG CTT -3’
      赛尔的siRNA专家曾经参与编写《RNA干扰:原理与应用》,在siRNA设计方面非常有经验,成功的为客户设计了数百条siRNA序列。
       
      问2:化学合成siRNA,编码shRNA载体构建生产siRNA,重组病毒导入siRNA, 我该采用哪种方法进行RNA干扰?
      答:化学合成siRNA:操作简便,研究人员得到合成好的siRNA后,进行简单的稀释处理即可实验,但是基因抑制持续时间短,对细胞毒性较大。
      编码shRNA载体构建生产siRNA:与化学合成siRNA相比:shRNA载体能够更有效阻遏相应基因的表达,可以用于稳定细胞系的建立,可以持续提供siRNA,携带GFP的载体可以用于检测转染效率。操作相对复杂,需要构建shRNA质粒。
      重组病毒包装siRNA: 实验操作相对复杂,对技术要求较高,费用较高,特别适合于一些难转染的细胞系(如原代细胞,干细胞)的siRNA干扰。
      所以客户要综合本实验的要求,成本等各个方面选择适合自己实验的RNA干扰方法。
       
      问3:为什么我采用国外文献已经公布并且确定的siRNA序列,通过脂质体转染的方法在我的细胞系中没有得到预期的干扰效果?
      答:
      国外文献已经公布并且确定的siRNA序列从序列本身来说应该没有问题,可能的情况是您的细胞系是否适用于常规的转染方法,对于转染效率低于50%的细胞系,我们建议采用重组病毒包装siRNA的方法。所以您首先要通过查阅文献或做一个GFP的对照实验检测一下您细胞的转染效率。
       
      问4:在转染过程中发现细胞死亡,应该怎么处理?
      答:
      常规的脂质体转染试剂都会对细胞有一定的毒性,这不用奇怪。按照我们的经验,如果细胞的死亡在30%以下,应该算是正常的。如果细胞的死亡大于60%,在排除其他操作的情况下,您就需要对转染条件进行优化,优化的过程一般包括以下几个方面:
      1. 调整转染试剂的浓度;
      2. 在转染后适当的时间内更换无转染试剂的培养液,
      3.调整细胞的生长状态;一般处于良好生长状态的细胞对转染试剂就有更好的耐受性;
      4.调整转染试剂和siRNA的比例
       
      赛尔生物相关服务
      MicroRNA服务 siRNA干扰 课题整体外包服务 基因克隆服务 慢病毒包装服务 腺病毒服务 稳定细胞株筛选服务 蛋白表达服务 酵母双杂交服务 抗体制备服务 DNA与蛋白相互作用研究 噬菌体展示技术服务 cDNA文库构建 干细胞研究 基金申请,标书撰写,专利申请,课题设计等
       
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